Rapport inactOGM

Rapport de validation

Procédure opératoire standardisée pour l'inactivation des organismes génétiquement modifiés

Résumé

Ces tests de validation ont été réalisés dans le laboratoire de biosécurité de niveau 1 de l'Association Hackuarium. Les cultures de bactéries et de nématodes ont été efficacement inactivées par l'exposition à de l'eau de Javel commerciale non diluée, telle qu'elle est utilisée dans la méthode d'inactivation standard. En revanche, l'eau n'a eu aucun effet sur la croissance ultérieure des cultures. Il est intéressant de noter que si les solutions d'eau de Javel à 10 % ont complètement empêché la poursuite de la croissance des bactéries (même si, visuellement sur les plaques, il n'y avait pas de changement évident), certains nématodes ont pu survivre à l'exposition à l'eau de Javel diluée. Par conséquent, il est nécessaire de poursuivre l'utilisation recommandée de l'eau de Javel non diluée par la méthode standard d'inactivation des organismes génétiquement modifiés dans ce laboratoire communautaire afin d'assurer une élimination ultérieure en toute sécurité dans les déchets généraux destinés à l'incinération.

Voici la version anglaise de ce rapport

Introduction

Tous les déchets biologiques (génétiquement modifiés ou non) provenant du laboratoire communautaire Hackuarium sont inactivés par immersion dans un désinfectant approprié (par exemple l'eau de Javel) afin d'être éliminés en toute sécurité dans les ordures ménagères destinées à l'incinération en Suisse. Les organismes de niveau de biosécurité I (ou P1), ainsi que les éventuels contaminants des cultures (par exemple les moisissures) doivent toujours être inactivés pour être éliminés en toute sécurité. Afin de valider la méthode habituelle d'inactivation des organismes génétiquement modifiés (OGM) dans le

laboratoire P1, des comparaisons ont été effectuées afin de déterminer expérimentalement si la méthode standard était suffisante pour inactiver les organismes génétiquement modifiés bactériens ou nématodes. La méthode ne peut être considérée comme validée que si elle est couronnée de succès grâce à ces preuves empiriques.

Le procédure opératoire standardisée pour l'inactivation des OGM concerne spécifiquement les cultures sur plaque. Les expériences de validation ont été réalisées avec de l'eau de Javel commerciale (Coop 'Prix Garantie') et sont applicables à la fois aux bactéries et aux vers nématodes transformés avec des plasmides résistants aux antibiotiques. Le chlore de l'eau de Javel peut détruire rapidement les bactéries, les virus et les champignons, et des travaux récents montrent qu'il tue les cellules en devenant l'acide hypochlorite, qui, même à des concentrations assez faibles, peut faire se déplier les protéines et les faire se coller entre elles. En tant que gaz, le chlore peut être très toxique et attaquer le matériel génétique des cellules. Les utilisateurs de laboratoires doivent donc toujours s'assurer d'une ventilation suffisante lorsqu'ils effectuent ce protocole d'inactivation sur leurs cultures en vue d'une élimination en toute sécurité.

Ces tests de validation utilisent des "colonies" et des "pelouses" bactériennes comme mesures très sensibles de l'efficacité de la méthode d'inactivation. Une "colonie" bactérienne consiste en une tâche discrète de croissance bactérienne, qui a commencé à partir d'une seule cellule sur le milieu solide de la plaque, tandis qu'une pelouse bactérienne provient d'un si grand nombre de cellules bactériennes placées initialement sur la plaque, qu'aucune tâche individuelle ne peut être observée. La concentration de bactéries mises à la plaque avec une technique stérile ("inoculée") est le principal déterminant de l'apparition de colonies ou de pelouses après une nuit d'incubation à la température appropriée.  (Il y a des exceptions, car les bactéries très mobiles peuvent se déplacer, de sorte qu'il est impossible de savoir, à moins de faire de la microscopie vidéo à intervalles réguliers, comment la colonie se forme exactement. Certaines de ces bactéries "swarmer" ont été utilisées dans le contexte des laboratoires communautaires et sont assez intéressantes, présentant même parfois une morphologie de "galaxie spirale" au lieu d'un simple cercle de croissance. Toutefois, pour le "cheval de bataille" de la biologie moléculaire, E. coli, utilisé pour ces validations, une colonie provient toujours de la croissance clonale d'une seule cellule). En ce qui concerne les limites de détection et l'objectif de pouvoir observer une cellule bactérienne vivante, une seule colonie après une nuit de croissance est facilement observée, même si plusieurs millions de cellules mortes ont été inoculées sur la plaque.

Une pelouse d'E. coli est généralement utilisée comme substrat alimentaire pour les nématodes C. elegans, et la présence d'animaux vivants est facilement contrôlée par l'apparition de "pistes" ou de "traces" laissées dans la source de nourriture par les vers qui se nourrissent des bactéries.  Si un seul ver survit sur plusieurs milliers, on observe la trace qu'il a laissée en se nourrissant.  Pour que le test soit encore plus instructif dans le cas des nématodes, nous avons commencé par des cultures affamées de C. elegans, dans lesquelles un stade larvaire spécial "semblable à une spore", appelé stade "dauer" et capable de résister à de nombreuses contraintes pour survivre jusqu'à ce que les conditions soient meilleures, ont constitué la base initiale du test.

À noter :

• Tous les déchets liquides issus des procédures expérimentales, par exemple les surnageants des préparations de plasmides, sont inactivés par l'ajout d'eau de Javel à une concentration finale de 10 % et laissés à tremper pendant au moins 10 minutes avant d'être jetés à l'égout dans le grand évier arrière de l'espace coopératif. Comme aucune culture de plus de 500 ml n'est autorisée, et que ces quantités ne le sont que rarement, cela signifie que l'on n'utilise jamais trop d'eau de Javel. Comme l'ancien autoclave du Hackuarium a été abandonné à Renens, parce qu'il était énorme, inefficace sur le plan énergétique et assez ancien, cette méthode pour les petits volumes semble justifiée.
• Le laboratoire communautaire réserve l'utilisation de son grand autocuiseur à la stérilisation, et jamais au traitement des déchets.
• Les expériences de validation ont été enregistrées dans l'outil en ligne Evernote, pour les nématodes, et les bactéries, et les images du processus ont également été sauvegardées dans un dossier Google Drive.

La méthode

Une comparaison de trois conditions, comprenant deux concentrations d'eau de Javel et d'eau, a été effectuée pour les cultures bactériennes transformées ou les nématodes, afin d'évaluer l'efficacité de la procédure habituelle avec de l'eau de Javel non diluée pour l'inactivation des cultures.  

Les membres de laboratoire communautaire formés à l'utilisation de l'espace de laboratoire P1 doivent toujours garder à l'esprit que les solutions d'eau de Javel sont classées comme irritantes et corrosives, et qu'elles doivent :

• Travailler dans un endroit bien ventilé.
• Porter un EPI composé d'une blouse de laboratoire, d'une protection oculaire et de gants.
• Utiliser de l'eau froide pour éviter la décomposition chimique.
• Etiqueter et dater la solution avec la date de préparation et les initiales et la jeter après utilisation.
• Retirez les EPI, y compris les gants, et lavez-vous soigneusement les mains.
• Sachez qu'il y a non seulement une douche oculaire sur l'étagère de sécurité du laboratoire P1, mais aussi une douche près du grand évier de l'espace. Le contact avec des solutions d'eau de Javel peut provoquer des irritations et des brûlures des yeux ou des muqueuses. Si l'eau de Javel entre en contact avec les yeux, rincez-les immédiatement à l'eau pendant au moins 15 minutes. En cas de contact de la peau avec l'eau de Javel, rincer à l'eau tiède pendant au moins 5 minutes.

Pour les tests de validation, les conditions les plus difficiles ont été choisies pour la procédure SOP, une loi de bactéries totalement confluentes ou des cultures de C. elegans affamées, dans lesquelles on s'attend à trouver des larves dauer.

Pour les bactéries :

Des plaques d'une souche d'E. coli transformée et fluorescente ont constitué le point de départ des tests. Trois concentrations différentes de ces bactéries ont été placées, de sorte qu'une pelouse complète, une pelouse moins dense et une pelouse avec des colonies individuelles évidentes ont été obtenues. Celles-ci ont été traitées sur la plaque, comme dans la méthode SOP habituelle, avec des incubations de 5 minutes et un tourbillonnement.  Cependant, la plaque la moins dense a été traitée avec de l'eau, la plaque la plus dense (ou "confluente") a été traitée avec une dilution d'eau de Javel de 1 pour 10, tandis que la pelouse de bactéries transformées et fluorescentes a été traitée avec de l'eau de Javel non diluée.

Pour les souches de nématodes :

Des plaques affamées de deux souches différentes de C. elegans ont constitué le point de départ des tests. Dans ce cas, les organismes ont d'abord été lavés des plaques, puis traités dans de petits tubes "microfuge" avec 1) de l'eau, 2) une dilution d'eau de Javel de 1 pour 10, ou 3) de l'eau de Javel non diluée.

Dans les deux cas, des plaques de culture secondaires ont été préparées pour chaque série de traitements et leur croissance a été évaluée.

Résultats

Pour la culture bactérienne traitée avec de l'eau de Javel non diluée, la couche cellulaire a été pratiquement dissoute, tandis que les colonies denses de la deuxième plaque traitée avec la dilution 1/10 sont restées évidentes. Le traitement à l'eau n'a pas beaucoup perturbé les colonies de la troisième plaque, bien que de nombreuses cellules aient rendu le liquide récupéré trouble.  Parmi les cultures secondaires, cependant, seules les plaques inoculées avec des bactéries provenant de la plaque traitée à l'eau étaient pleines de colonies fluorescentes et transformées.  L'eau de Javel diluée et l'eau de Javel non diluée ont complètement inactivé les cellules, de sorte qu'aucune croissance ou fluorescence n'a été observée.

Pour les vers nématodes, seul le traitement à l'eau a permis d'observer des vers sur les plaques secondaires.  Cependant, une plaque provenant d'un des traitements avec une dilution de 1 sur 10 présentait quelques vers survivants, dont au moins un Roller (signe de rétention du transgène dans cette souche).  Aucun survivant n'a été observé après le traitement à l'eau de Javel non diluée.  (Toutes les plaques ont été vérifiées à nouveau après quelques jours, pour confirmer si d'autres traces avaient été faites dans l'épaisse pelouse bactérienne).

Discussion

Ces résultats montrent que le protocole d'inactivation tel qu'il est décrit dans la procédure opératoire standardisée avec de l'eau de Javel non diluée est efficace et peut être considéré comme validé. Bien que les traitements à 10 % de ces cultures bactériennes puissent être considérés comme sûrs d'après ces résultats, il est toutefois plus prudent de conserver la méthode actuelle, car d'autres bactéries ou contaminants de culture, en particulier ceux qui peuvent former des spores, comme Bacillus ou les moisissures, pourraient être beaucoup moins sensibles à l'eau de Javel diluée.

Pour les travaux sur les vers nématodes, il est clair que seule l'eau de Javel à pleine concentration doit être utilisée, car la forme dauer peut survivre après une exposition à une dilution de 1/10 de l'eau de Javel.

D'autres tests pourraient être effectués pour comparer d'autres marques commerciales d'eau de Javel. Cependant, comme cette validation était basée sur une marque bon marché et qu'il semble probable que la plupart de celles que l'on trouve en Suisse ne seront pas très différentes, cela ne semble pas être un besoin urgent. Cependant, il faut toujours s'assurer que l'eau de Javel est stockée dans l'obscurité et qu'elle n'est pas utilisée au-delà de la date de péremption pour ces inactivations afin de garantir une élimination sûre.

Un autre point déjà abordé dans le dossier expérimental Evernote concerne l'idée de voir si les plasmides peuvent être récupérés à partir des solutions traitées, et pas seulement à partir d'organismes vivants. Toutefois, comme de tels tests nécessitent des cellules compétentes très efficaces, cette possibilité n'est que envisagée pour l'instant...

Références

Bases légales suisses: l'Ordonnance sur l'utilisation confinée (OUC, RS 814.912) et l'Ordonnance sur la protection des travailleurs contre les risques liés aux microorganismes (OPTM, RS 832.231).

Ces réglementations s'appuient sur les lois suisses relatives à la protection de l'environnement (LPE, RS 814.012), au génie génétique (LGG RS 814.91), aux épidémies (LEp RS 818.101), ainsi que sur la convention sur la protection de la biodiversité (RS 0.451.43).