Micronuclei(fr)
Un protocole pour faire les tests de micronoyaux sur vos propres cellules buccaux
(comme tous les microbiologistes moléculaires le savent, chaque chercheur aura sa façon particulière de faire le même chose … notre point de vue est que de nombreuses méthodes peuvent bien fonctionner et devraient être partagées davantage!)
Un protocole de recherche à faire ensemble (Do-It-Together) pour chercher des micronoyaux dans vos propres cellules buccales.
Note: Pour travailler bien, c'est idéalement par groupe de deux, et on compter les cellules les uns des autres après la préparation des lames.
Cela permet d'éviter les problèmes des erreurs de comptage, aussi due aux biais de déclaration humaine, croit-on.
Protocole:
- bien rincer sa bouche avec de l'eau
- utiliser une brosse à dents pour recueillir délicatement les cellules de la surface interne de la joue
- rincer la brosse à dents pour collectionner les cellules dans un petit bécher contenant environ 10 ml de solution saline
- verser le liquide dans un tube 15 ml conique pour permettre aux plus grosses touffes de cellules de se déposer et
- mettre la meilleure partie du liquide dans deux tubes de microcentrifugation
- centrifuger doucement (pas plus de 5 000 rpm / min) pendant 3 min
- verser les surnageants et répéter jusqu'à ce que toutes les cellules soient recueillies
- mettre ensemble les cellules des deux tubes dans un tube, dans environ 200ul de solution saline
- obtenir la concentration cellulaire de cette solution (vouloir viser 2000-5000 cellules par lame), en utilisant le hémocytomètre.
- mettre 10ul pour compter sur l'hémocytomètre (le calcul si vous comptez plusieurs cellules (X) de la taille du carré principal = (X * # cellules / X) par carré principal x10 ^ 4 / ml)
- Si nécessaire, centrifuger à nouveau pour concentrer les cellules à nouveau dans un petit volume, car, idéalement, pour les ’smears' des gouttes de moins de 50-100 μl, contenant environ 2000 cellules, seront déposées sur chaque lame.
- Assurez-vous que les lames sont propres et étiquetées avant de procéder à des ’smears' ou raclements des cellules
(Pour démontrer lors des ateliers )
- déposer environ 3/4 à la fin de la lame puis, avec le bord d'une deuxième lame propre, déplacer la goutte vers l'arrière, puis racler tout en avant (besoin des images aussi ...)
- Laissez chaque lame sécher à l’air (on peut placer sur une plaque chaude).
- Fixer les cellules sur la verre de la lame - à glisser en passant brièvement au-dessus d'une flamme (enlever la suie du bas avant de passer à la coloration).
(Fixation facultative avec du méthanol: acide acétique 3: 1).
- Colorer les cellules avec du bleu de méthylène (solution aqueuse à 0,5% et pour le fixation optionnelle - peut alors être préparée dans de l'éthanol ...)
Si vous avez des conteneurs de trempage des lames, des pots de coplin, tant mieux, mais vous pouvez également mettre une goutte sur la lame. Laisser la tache sur au moins 1 min puis rincer avec des gouttes d'eau, en recueillant le liquide de déchet bleu * dans un bécher. Laisser sécher l'échantillon et examiner au microscope à un grossissement d'environ 200x.
La quantification est cruciale - les micronoyaux peuvent provenir de processus normaux, mais une augmentation de 2-4 / 1000 à 20 ou plus pour 1000 cellules de la joue pourrait signifier qu'on devrait considérer des expositions environnementales délétères ...
La figure 1 montre un exemple de cellule de joue contenant un micronoyau, étalé, fixé et coloré simplement avec du bleu de méthylène.